Cell-on-Chip: In immer mehr Forschungsfeldern wird die Miniaturisierung sowie Übertragung der Zellkulturen und kompletter Assays auf ein Lab-on-a-Chip-System angestrebt. Einerseits wird durch die reduzierten Analysenflächen ein geringer Probeneinsatz notwendig, andererseits ist eine Beobachtung des Zellverhaltens in Echtzeit möglich. Dreh- und Angelpunkt zur erfolgreichen Realisierung solcher Lab-on-a-Chip-Verfahren sind hochpräzise und pulsationsfreie Dosiersysteme. Unsere CETONI Nemesys Spritzenpumpen werden in zahlreichen Laboren, u.a. zur Realisierung mikrofluidischer Analysen eingesetzt.
Wir haben deshalb 10 Tipps zusammengestellt, von denen Einsteiger und erfahrene Forscher bei Ihrer Arbeit profitieren können.
1. Das richtige Chipmaterial
Die Anforderungen an das Chipmaterial für die Zellkultivierung sind hoch. Nicht nur die Biokompatibilität, sondern auch eine hohe Transmissionseigenschaft sollte das Material aufweisen. Daher wird in den meisten Arbeiten auf die Polymere PDMS (Polydimethylsiloxan) oder COC (Cycloolefin-Copolymere) zurückgegriffen. Dennoch besitzt auch PDMS einige Nachteile aufgrund der Gaspermeabilität und es ist nicht beständig gegenüber Chemikalien, wodurch COC oder Glas immer mehr in den Vordergrund rücken.
2. CO2-unäbhängige Zellkulturmedien
CO2-unabhängige Medien sind fertige Formulierungen, die HEPES-(2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure)- unabhängig ein Puffersystem, z.B. basierend auf mono- und di-basischen Natriumphosphat und β-Glycerophosphat aufbauen. Für den Erhalt des Puffersystems ist daher die Zufuhr von CO2 nicht notwendig.
3. Abgesetzte Zellreservoire
Im Gegensatz zur Durchflusszellkultivierung werden durch den Einsatz von Kavitäten (herabgesetzte Zellreservoire) die Zellen vor Scherstress geschützt sowie ein positives Mikroklima innerhalb des Reservoirs aufgebaut.
4. Beschichtung begünstigt Zelladhäsion
Für die Förderung der Zelladhäsion sind viele verschiedene nasschemische Beschichtungssubstanzen bekannt. Dabei sind Kollagen, Gelatine oder das Substanzgemisch Matrigel® am meisten verbreitet. Je nach eingesetzter Zellkultur muss die Eignung anhand eines zeitabhängigen Wachstumsprofils untersucht werden.
5. Exakte Steuerung des Flusses
Eine zu hohe Flussrate kann nicht nur die Adhäsion der Zellen verhindern, sondern diese sogar ablösen, beides ist eine Folge zu hoher Scherstresses. Eine zu niedrige Flussrate wiederum würde keine ausreichende Zufuhr mit Nährstoffen für die Zellen bedeuten. Letztendlich muss man einen Kompromiss wählen, bei dem die Flussrate an den Glukoseverbrauch der Zellen angepasst ist.
6. Konstante Temperaturen
Miniaturisierte, zellbasierte Sensoren erlauben durch die Inkubator-unabhängige Beobachtung die ganzheitliche Aussage zu zellphysiologischen Prozessen in Echtzeit. Dafür ist aber die Aufrechterhaltung von 37 °C zur Kultivierung humaner Zellen notwendig. Insofern werden bei der Heizung eines Inkubator-unabhängigen Systems unterschiedliche Ansätze verfolgt. Peltierelemente, Heizfolien oder Objektträger, welche mit einer ITO (Indium Tin Oxide) – Beschichtung versehen wurden. Die ITO Beschichtung bietet bei einer gleichmäßigen Temperaturverteilung auch eine hervorragende optische Transparenz für gleichzeitig-lichtmikroskopische Untersuchungen der Zellkultur.
7. Minimierung von Gasblasen
Neben der generell anzustrebenden luftfreien Befüllung des Systems, ist die größte Herausforderung in der Mikrofluidik verbleibende Gasblasen im Chipsystem zu reduzieren. Sehr häufig werden dafür Medien vorher entgast oder sogennante „Blasen-Fallen“ (engl. bubble traps oder degasser) im Prozess eingesetzt. Diese stellen nicht nur einen apparativen Aufwand und potenzielles Kontaminationsrisiko dar, sondern erschweren darüber hinaus ebenfalls die pulsationsfreie Förderung. Ein anderer Ansatz bedient sich dem Gesetz von Henry, wobei der Anteil des in einer Flüssigkeit gelösten Gases proportional zum Druck ist. Im übertragenen Sinne begünstigt die leichte Druckerhöhung im System die Löslichkeit von kleinsten Gasenblasen im System, welche somit Ihre störende Wirkung verlieren. Diesen Effekt kann man sich durch die richtige Platzierung eines Gegendruckregulators (engl. Abk. BPR (back-pressure-regulator)) zu nutze machen, welcher einen fluidischen Widerstand darstellen und dementsprechend für einen den gewünschten Druckanstieg in Abhängigkeit von der eingestellten Flussrate sorgt (falls für die jeweilige Anwendung geeignet).
8. Ein kontinuierlicher Fluss
Um Zellen möglichst homogenen Bedingungen auszusetzen und kontinuierlich mit Nährstoffen zu versorgen ist ein kontinuierlicher und pulsationsarmen Fluss essentiell. Durch die anschließende Inkubation mit entsprechenden Testsubstanzen lassen sich im Nachhinein aussagekräftige und reproduzierbare Ergebnisse generieren.
9. Kontaminationsrisiko senken
Eine kontaminierte Zellkultur ist ein Albtraum für jeden Zellforscher. Besonders bei der Inkubator-unabhängigen Cell-on-Chip Forschung ist die Gefahr einer Kontamination entsprechend hoch und sollte besonders aufmerksam beobachtet werden. Der Einsatz von speziellen Sterilfiltern vor und nach dem Chipsystem unterstützt dabei die kontaminationsfreie Kultivierung. Besondere Aufmerksamkeit sollte hier natürlich der Fluidanschlusstechnik und dem Fördersystem gelten. Durch den gezielten Einsatz von Einweg- oder autoklavierbaren Komponenten wie Spritzen und Ventilen eignen sich die modularen nemesys Spritzenpumpen hervorragend für diesen Einsatzzweck.
10. Die Zelleinsaat
Der Zelleinsaatprozess im Chipsystem ist besonders kritisch, da die gleichmäßige Zellverteilung einen entscheidenden Einfluss auf die Aussagefähigkeit des Experimentes hat. Das Einbringen der Zellen in ein vollständig assembliertes mikrofluidisches System erfordert entweder etwas Fingerspitzengefühl oder konstruktive Mechanismen, die eine gleichmäßige Zellverteilung gewährleisten. Dabei kann man folgende Methoden zum Zelltrapping unterscheiden: hydrodynamisch, optisch, magnetisch, elektrisch oder akustisch.
